高剂量甲氨蝶呤(HDMTX)治疗对急性淋巴细胞白血病(ALL)、淋巴瘤和骨肉瘤具有确证疗效。然而，这种高剂量MTX的应用方式可能因为易导致急性肾损伤(AKI)的发生而应用受限，而且还可能随之导致因甲氨蝶呤清除延迟(DME)，患者会发生各种MTX相关毒副作用。即便采取尿液碱化等支持性治疗措施，仍有2%-33%的高剂量甲氨蝶呤治疗患者发生AKI[4-6]。因此，及早发现AKI对预防后期不可逆的MTX相关毒性至关重要。
通常临床会采用血清肌酐(Scr)来检测是否发生AKI，但是这种方法需要连续检测，而且其显著升高可能出现在AKI发生后48-72小时。为克服这一困难，研究人员开发了一些新型标志物，例如中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白(NGAL)，在HDMTX治疗患者中显示了良好的前景。但是作为新指标，不仅需要额外的检测成本，而且要针对不同年龄、诊断类型等进行临床验证。
其实在HDMTX治疗中，MTX浓度(MTXC)检测是常规项目，也被用于检测肾脏MTX的清除。现有的指南建议根据HDMTX灌注后36、42、48小时的MTXC浓度来进行葡萄糖苷酶的治疗。但当AKI在灌注早期发生时，这几个时间点则可能错过了预防永久毒性的试剂。本研究旨在通过对大量HDMTX治疗的数据评估，确定HDMTX治疗后早期MTX清除是否可作为AKI的早期清除生物标志物。
本研究的调查样本来自西班牙的2个独立机构的169例患者。这些患者均在MTX输注完成后16小时采集超过2次MTX浓度。对于AKI采用AKIN标准来评判，严重AKI需达到2-3级AKI的标准；对于DME采用两个标准。一个是微摩尔标准判定HDMTX输注开始42小时后任一时点MTXc>IμM即存在DME；一个是20标准差(SD)标准判定：若MTXPKorg测定的MTXc值在输注开始后42或48小时偏离人群均值超过2个标准差，则判定存在DME。所有输注完成后16小时后测得的MTXc值被输入MTXPKorg模型中预测42小时或48小MTXc，作为判断DME的标准。MTX浓度随时间的变化被划分为三个独立时间段，分别为："第一"时段为2.5小时内；"第二"时段为2.5至8.5小时；"第三"时段为8.5至16小时。若同一时段内存在两次及以上检测值，则采用最接近MTX输注结束时间的数值。对于24小时输注，若在输注结束前5小时内采集的浓度值，则将其归为第0小时。其次，通过组合三个时间段中的任意两个时段(即"第一"与"第二"、"第一"与"第三"、"第二"与"第三")采集的MTX浓度数据，计算出两项独立的早期MTX清除生物标志物：消除半衰期与斜率(MTXe浓度下降速率)。
研究对象包括169例患者，共接受556个疗程的HDMTX治疗。患者中位年龄为10.3岁(四分位间距4.2-37.3)，其中114例(67.5%)确诊时年龄未满18岁。三分之二(66.9%)患者确诊为B细胞系急性淋巴细胞白血病。在556个可获取疗程数据中，329个(59.2%)在三个指定时间点均完成MTX浓度检测，且83%的疗程采用长效输注(24时)。首次、第二次和第三次MTX检测的中位采集时间分别为输注完后0.17小时(四分位间距0.00-0.68)、6.28小时(四分位间距4.00-6.62)和12小时(四分位间距11.8-12.8小时)(如图1所示)。
图1 输注完成后甲氮蝶呤测定值的时间段分类
ROC分析显示，在第二与第三时间段间测得的MTX消除半衰期在不同时间段组合中，该指标对急性肾损伤(AKI)的AUC值最高。作为早期清除生物标志物，其对任何分级AKI的AUC表现最佳：AKII级为0.62(四分位间距0.56-0.69)，AKII级为0.65(四分位间距0.54-0.77)；对重度AKI的区分度尤为显著；对微摩尔浓度标准的糖尿病性黄斑水肿(DME)同样具有高区分度(AUC 0.79，四分位间距0.54-0.77)。该指标同时能有效鉴别(DME)，微摩尔标准下AUC为0.79(四分位间距0.73-0.84)，标准差(SD)标准下AUC达0.86(四分位间距0.73-1.00)(表1，图2)。在第二和第三时间段之间分别对应24小时和4小时输注获得的消除半衰期中位数为2.95 小时(四分位间距2.51-3.47)和2.51小时(四分位间距 2.34-2.80)。
表1 早期清除生物标志物(斜率与消除半衰期)的曲线下面积(AUC)
图2 基于第二和第三时段测量值计算的甲氨蝶呤消除半衰期接收者操作特征(ROC)曲线。(A)微摩尔标准下的DME；(B)标准差标准下的DME：(C)任何级别的急性肾损伤(AKI)；(D)2-3级AKI。
在调整年龄、性别、剂量、输注时间、HDMTX疗程及基线eGFR后，第二与第三时段间的消除半衰期对AKI仍具统计学意义，比值比为1.29，95%置信区间[1.03，1.65]，p值为0.031，通过似然比检验比较含/不含早期清除生物标志物的模型，结果表明生物标志物显著提升了整体性能，其p值为0.006。
在进行AKI发生预测敏感性分析中，利用第二到第三阶段测得的半衰期作为早期清除生物指标表现稳定。对于各种级别AKI，该生物指标的AUC是0.61(IQR 0.55-0.68)，对于严重AKI的AUC是0.64 (IQR 0.52–0.76)。对于DME的预测，采用微摩尔标准AUC是0.78(IQR0.72-0.83)，采用SD标准AUC是0.84(IQR0.67-1.00)。
本研究旨在确定在HDMTX治疗中，输注结束后早期消除MTX是否可作为AKI的早期清除生物标志物。结果显示通过第二阶段和第三阶段MTX浓度变化是与AKI的发生有关联的。由于该检测的时间点远早于血清肌酐的升高时间点，因此在早期识别AKI风险上优于血清肌酐。这种时间上的优势非常重要，比如指南给与的葡萄糖苷酶最佳AKI预防干预时间是HDMTX输注开始48到60小时，否则药物毒性可能不可预防。
本研究的关键优势在于采用综合方法筛选和评估甲氨蝶呤早期清除生物标志物。首先运用ROC分析评估并筛选出最具潜力的候选生物标志物，随后通过该分析确立甲氨蝶呤消除半衰期作为早期清除生物标志物的鉴别能力，从而揭示敏感性与特异性之间的权衡关系。鉴于此类分析仅考虑单一变量，研究进一步采用多变量逻辑回归模型，在纳入不同混杂因素后强化了结论的可靠性。